對(duì)流免疫電泳是在瓊脂擴(kuò)散基礎(chǔ)上結(jié)合電泳技術(shù)而建立的一種簡(jiǎn)便而快速的方法。此方法能在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)結(jié)果，故可用于快速診斷，敏感性比雙向擴(kuò)散技術(shù)高10-15倍。

    血清蛋白在PH8.6條件下帶負(fù)電荷，所以在電場(chǎng)作用下都向E極移動(dòng)。但由于抗體分子在這樣的PH條件下只帶微弱的負(fù)電荷，而且它的分子量又較大（為r球蛋白）。所以游動(dòng)慢。更重要的是抗體分子受電滲作用影響較大，也就是說(shuō)點(diǎn)滲作用大于它本身的遷移率。所謂電滲作用是指在電場(chǎng)中溶液對(duì)于一個(gè)固定固體的相對(duì)移動(dòng)。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性緩沖液中進(jìn)行電泳，它帶有負(fù)電荷，而與瓊脂相接觸的水溶液就帶正電荷，這樣的液體便向負(fù)極移動(dòng)。抗體分子就是隨著帶正電荷的液體向負(fù)極移動(dòng)的。而一般的蛋白質(zhì)（如血清抗原）也受電滲作用的影響，使泳動(dòng)速度減慢，但它的電泳遷移率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于電滲作用。這樣抗原體就達(dá)到了定向?qū)α鳎趦烧呦嘤銮冶壤线m時(shí)便形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線。

（一）材料

1、診斷血清：免抗人免疫血清

2、待檢血清：人血清

3、陰性對(duì)照血清

4、pH8.6、離子強(qiáng)度0.05M緩沖液配方：1.84克，鈉10.3克，加蒸餾水1000毫升，調(diào)pH至8.6。

5、緩沖瓊脂板：將純化的瓊脂用PH8.6離子強(qiáng)度0.025的緩沖液（用0.05M的緩沖液稀釋一倍即可）配成1.5%的瓊脂，加入 0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱內(nèi)備用。

6、電泳儀

7、其他：生理鹽水、打孔器、微量進(jìn)樣器

（二）方法

1、瓊脂板的制備根據(jù)需要可選用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）兩種。大玻板約需瓊脂10毫升，小玻片約需3.5毫升，凝固后按圖打孔，方法同瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。

2、加樣：左側(cè)孔內(nèi)加患者血清（原血清及10倍稀釋血清各占一孔），右側(cè)內(nèi)加抗血清，每片應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照。

3、電泳

    用國(guó)產(chǎn)普通電泳儀。其內(nèi)加0.05mPH8.6的緩沖液，加至電泳槽高度的三分之二處，注意兩槽內(nèi)液面盡量水平。將加好樣品的玻板置于電泳槽上，抗原端接負(fù)極，抗體端接正極，用2—4層濾紙浸濕作鹽橋，濾紙與瓊脂板聯(lián)接處為0.5厘米。以板寬度計(jì)算電流，以板的長(zhǎng)度計(jì)算電壓。要求電流量為2— 3毫安/厘米，即大板為20毫安，小板為10毫安。電壓為4—6伏/厘米。通電45分鐘—2小時(shí)后觀察結(jié)果。

4、結(jié)果觀察

    在黑色背景上方，用散射光多個(gè)角度觀察，在對(duì)孔之間有白色沉淀線即為陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。如果抗原，兩極微沉淀?xiàng)l紋不清晰，于37℃保溫?cái)?shù)小時(shí)可增強(qiáng)沉淀?xiàng)l紋的清晰度。

5、影響結(jié)果的因素

（1）抗原抗體的比例：抗原抗體比例適應(yīng)時(shí)容易出現(xiàn)沉淀帶，反之不易發(fā)生。當(dāng)抗體濃度恒定時(shí)，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時(shí)，作10倍、20倍或更高倍數(shù)稀釋可以提高陽(yáng)性率。隨稀釋度的增加，抗原抗體的比例發(fā)生變化，沉淀線由靠近抗血清孔向逐步移向兩孔中間，并可出現(xiàn)不典型的沉淀線如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽(yáng)性，應(yīng)予注意。

（2）組電泳緩沖液其電泳結(jié)果以鈉—鹽酸緩沖液靈敏度zui高。—鈉次之。Tris緩沖液更差。

（3）電壓與電流時(shí)電泳時(shí)間需要長(zhǎng)些：電壓電流增大時(shí)，電泳時(shí)間可更短。但電壓過(guò)高則孔徑變形，電流過(guò)大抗原抗體蛋白易變性，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般選擇每厘米5毫升，電泳時(shí)間改為1.5小時(shí).

上一篇 改良過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法制備酶標(biāo)抗體 下一篇 抗原的分類