1.抗Ⅲ抗體Elisa試劑盒應(yīng)該在細(xì)胞狀態(tài)的時候,進(jìn)行病毒接種或復(fù)蘇;

2.接種前頭天,進(jìn)行細(xì)胞傳代,細(xì)胞數(shù)量應(yīng)以能讓細(xì)胞在第二天內(nèi)達(dá)到覆蓋滿90%的培養(yǎng)瓶為準(zhǔn),并且一定要在細(xì)胞傳代后48h內(nèi)接種病毒;

3.第二天細(xì)胞長為單層且狀態(tài)較好時,開始接種病毒;

4.先移棄培養(yǎng)瓶中的生長液,用1*PBS輕輕洗細(xì)胞面3次,zui后用移液管吸干凈培養(yǎng)瓶中殘留的1*PBS.為保持培養(yǎng)瓶中pH環(huán)境的穩(wěn)定,及減少1*PBS對細(xì)胞的刺激作用,可再用生長液輕輕洗細(xì)胞面1次,移棄液體,并用移液管吸干凈瓶中殘留生長液;

5.接種病毒:
①. 一般種毒量按zui后所需加入維持液體積的10%,15%或20%來計算,一般10%即可,若希望病變速度快一些,可以加大種毒量,如15%或20%;
②. 如果用小塑料瓶種毒,一般該培養(yǎng)瓶加8-9ml培養(yǎng)液,加入0.8ml病毒即可,病毒加入后,蓋上瓶塞,輕輕將搖晃瓶子,讓病毒液在細(xì)胞面上來回10幾次;
③. 在對照細(xì)胞中,加入相同的0.8ml維持液;

6.將種毒瓶和對照瓶一起放入37oC,CO2烘箱培養(yǎng)1h,其中每隔15min,需要將種毒瓶和對照瓶拿出,輕輕搖晃瓶子,保證病毒液或維持液能在細(xì)胞面上來回20-30次,使病毒液或維持液能充分接觸細(xì)胞;

7.1h后,在晃動瓶子4次后,重新進(jìn)入無菌間,在培養(yǎng)瓶中加入維持液;
①. 維持液配方一:
MEM 2鸖 3% 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調(diào)節(jié)pH至7.0為準(zhǔn),濃度為6%);
②. 維持液配方二:
MEM 3% 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調(diào)節(jié)pH至7.0為準(zhǔn),濃度為6%);
③. 一般還是使用有FBS的維持液,因為對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用;

8.將加完維持液的培養(yǎng)瓶放回37oC,CO2烘箱培養(yǎng),每天觀察,如果有條件,可以每天拍照,直到有90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE后,可以進(jìn)行收毒;

9.收毒可以用反復(fù)凍融方法:即將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入-20oC冰箱,凍起來后,直接拿出來等起融化后,使勁搖晃瓶子,讓細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒,這樣反復(fù)4次,即可達(dá)到收毒目的;

10.收毒后的病毒液可以用移液管吸入離心管,在1,000-2,000轉(zhuǎn)下離心10mins,以此除去細(xì)胞碎片,將離心后的上清夜轉(zhuǎn)移,棄底部沉淀,該上清液即可用于病毒濃縮醇化,抗Ⅲ抗體Elisa試劑盒或病毒滴度測定,或中和試驗等.
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